5.2.2. Typisierungsmethoden

Die Einführung von molekularbiologischen Techniken umfasst eine Vielzahl von DNA-basierten Typisierungsverfahren, die der Unterscheidung von Arten sowie der Isolierung bestimmter Spezies dienen. Die Daten, die diese Methoden liefern, verschafft Einblick in die Verbreitung und Persistenz von (pathogenen) Mikroorganismen nicht nur in Lebensmitteln, sondern auch in der Umwelt. Somit können die DNA-basierten Typisierungsmethoden für epidemiologische Zwecke verwendet werden, was helfen kann, unabhängig von Infektionen von einem einzigen Isolat verursachte Epidemien zu erkennen. Dies ist von besonderer Bedeutung, da dies die Durchführung von präventiven und hygienischen Maßnahmen erleichtern kann.

Genotypisierungsmethoden werden in der Regel in Abhängigkeit von technischen Aspekten kategorisiert. Folgendes Methoden stehen zur Verfügung:

• DNA-Sequenzierung;

• Restriktive Endonukleasen für die Analyse von plasmidischer und/oder genomischer DNA (z. B. Restriktionsfragmente-Längen-Polymorphismen (RFLP), Pulse Filed Gelelektrophorese (PFGE));

• als Sonde fungierende Techniken (Markierungsverfahren);

• PCR-basierte Techniken (Amplifikationsverfahren wie RAPD-DNA (RAPD) und amplifizierte Fragmente-Länge-Polymorphismen (AFLP)).

Mit Restriktionsfragmente-Längenpolymorphismen (RFLP) lässt sich die natürliche Variabilität von DNA-Molekülen (Chromosomen, Plasmiden und mitochondriale DNA in Eukaryonten) bezüglich der Position und der Anzahl von 6- bis 8-mer-Sequenz entlang dieses Moleküls untersuchen. Das Schneiden der DNA mit Restriktions-Endonukleasen führt zur Erzeugung von Fragmenten unterschiedlicher Länge, die mit Ethidiumbromid nach dem Färben (im Falle einer begrenzten Anzahl von Fragmenten, beispielsweise weniger als 50) durch Agarose-Gelelektrophorese (AGE) visualisiert und entweder direkt getrennt oder nach einer Hybridisierung mit spezifischen Sonden markiert werden können.

Die Pulse Filed Gelelektrophorese (PFGE) ist eine Technik, bei der große DNA-Moleküle, wie etwa Chromosomen, untersucht werden können. Sie kann auch nach dem Schneiden mit Restriktionsendonukleasen, die eine begrenzte Anzahl von Fragmenten erzeugen, auf große DNA-Fragmente angewandt werden. Chromosomen oder andere große Fragmente sind sehr nützlich bei der Stamm-Identifikation.

Sonden-basierte Methoden (Markierungsverfahren). Diese Verfahren betreffen den Einbau von Fragmenten am Ende einer Nukleinsäure. Es gibt verschiedene Varianten der Basismethode, je nach verschiedenen Faktoren spezifiziert. Sie betreffen die Art der Nukleinsäure, ihre Größe und Menge, 4 Markierungsverfahren; es lassen sich folgende Varianten aufführen: die 3 'und 5'-Ende-Etikettierung, eine zufällige Markierung durch Nick-Translation und die Random-Prime-Kennzeichnung. Mit Markierungsmolekülen lassen sich radioaktive und nicht-radioaktive Markierungen vornehmen. Bei der radioaktiven Markierung mit Radioisotopen erfolgt der Nachweis durch Autoradiographie, während bei einer nicht-radioaktiven Markierung Fluoreszenz, Chemolumineszenz oder enzymatische Reaktionen im Untersuchungsfokus stehen.

PCR-basierte Techniken (Amplifikationsverfahren). Bei diesen Verfahren die in vitro enzymatische Amplifikation der Nukleotidsequenz für die Dehnungsidentifizierungszwecken untersucht. Sowohl grundlegende PCR-Protokoll und seine Modifikationen sind leistungsfähige Werkzeuge für die Amplifikation einer DNA-Sequenz von Interesse, Erkennung und Typisierung von Produktion, verunreinigen und pathogenen Stämmen. Zu der breiten Vielfalt der PCR-basierten Verfahren Targeting direkte Identifizierung eines bestimmten Organismus in einem Nahrungsmittelprodukt die RAPD und AFLP-Analysen sind die am häufigsten verwendet.

Random Amplified Polymorphic DNA (AFLP) ist eine „random-type“-PCR-Technik, die auf der Amplifikation einer DNA-Region ohne vorherige Informationen über eine bestimmte Zielsequenz basiert. Mit Hilfe von 10-mer-Primern kann Kontrolle über die Amplifikationsbedingungen bei einer Reihe von verstärkten Sequenzen gewonnen werden, die in der Regel hoch spezifisch sind. Dieser Umstand erlaubt es, durch die Verwendung von RAPD-PCR Mikroorganismen-Populationen zuverlässig zu unterscheiden.

Amplified Fragments Length Polymorphisms (AFLP) stellen ein hochempfindliches Verfahren zum Nachweis von Polymorphismus bei Individuen dar, das sowohl für die inter- als auch die intra-Diskriminierung von Arten anwendbar ist. Dies wird durch die PCR RFLP von aus einem Pool ausgewählten DNA-Fragmenten vermittelt. AFLP-Screens für Polymorphismen betreffen die Länge der amplifizierten Fragmente, die durch eine selektive Amplifikation von erreicht wird. Das Verfahren umfasst die „Verdauung“ von genomischer DNA mit 2 Restriktionsendonukleasen durch die PCR-Amplifikation der erhaltenen Fragmente. Die Restriktionsfragmente werden im Voraus für die Amplifikation mit Adaptern verwendet, die spezifisch für die Endonukleasen modifiziert werden und somit als Primerbindungsstellen dienen. Die Primer selbst sind in einer Weise konstruiert, dass sie sich an die Adapter zu binden vermögen; und erlauben eine sehr spezifische Amplifikation aufgrund der Tatsache, dass nur Fragmente, die vollständig der Primer-Sequenz entsprechen, amplifiziert werden.